导读
细胞之邦，互助你我。感谢大家的关注，我是小邦。今天我们分享的是PCR实验中引物设计的问题。
设计PCR用引物时的注意事项?
可以从以下几个方面考虑：
1. 引物长度通常为20～25 mer。但进行LA PCR时，引物长度应增长为30～35 mer。
2. 二条引物之间不能进行Annealing，对3′端的3个碱基需特别注意
3. GC含量在50～60%，避开局部富含GC或AT，为了使引物和模板稳定结合，3′端应避开AT rich结构
4. 避开引物自身形成二级结构
5. 选择Tm温度相互接近的二条引物
PCR用引物的Tm值的计算方法?
引物为20 mer以下时： Tm = 2℃×(A+T) + 4℃×(G+C)
引物为20 mer以上时：   Tm = 81.5 + 0.41×(GC%) - 600/L ， 其中L为引物的长度。
在PCR反应过程中选择Annealing温度时，一般为 (Tm - 5)℃。
PCR用引物的使用量?
合适的终浓度可在0.1 μM～1.0 μM之间选择。引物的浓度太低时，有时扩增产物太少；引物浓度太高时，比较容易出现非特异性扩增反应。通常模板DNA的量较多或High complexity DNA (例如Human genome DNA) 作模板时，引物浓度应低一些；当模板DNA的量较少或Low complexity DNA (例如Plasmid等)作模板时，引物浓度应高一些。
简并性引物对PCR扩增有无影响?
有影响。简并数量应尽量少。通常一条引物中简并的碱基不要超过4处，如果简并的碱基数过多，则会造成反应体系中有效引物的量相对减少，此时应适当增加引物的使用量。但引物量过大，容易引起非特异扩增，应加以注意。

引物设计一般都用软件进行的，而且自己做的一般是针对单菌；若是环境样品的话，只能试文献中的各种引物，不建议自己设计。我觉得引物设计原则可以拿过来作为软件设计的标准对照
http://www.hlkbio.cn/news/110-cn.html 这里有关于如何用在线软件设计引物的方法，你可以看看